前言
 

苏州大学第一附属医院的林俊老师及其团队长期致力于骨关节退行性疾病诊疗，骨软骨组织工程，纳米生物材料等领域的研究，近期，在《JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY》发表了研究成果，该研究证明褪黑素可以缓解 Ti 粒子诱导的骨溶解，其作用主要是调节肠道微生物群和调节丁.酸盐生产能力。诺米代谢承担了部分项目技术，第一时间带大家一睹该研究风采！
 

文章题目
Melatonin alleviates titanium nanoparticles induced osteolysis via activation of butyrate/GPR109A signaling pathway
 

文章信息
合作单位：苏州大学第一附属医院
发表期刊：JOURNAL OF NANOBIOTECHNOLOGY
（IF = 10.435）
发表时间：2021
 

研究背景
 

人工关节置换术（Total joint replacement）作为各种终末期关节疾病的主要治疗手段，可以有效的减轻关节疼痛，改善功能，显著提高患者生活质量。但关节置换术后由于磨损颗粒导致骨溶解引起的无菌性假体松动是一个难以克服的临床问题。针对此难题，目前临床上确切的治疗方案是进行关节翻修术，手术难度大，同时给患者带来巨大的经济及心理负担。近期的研究表明，肠道菌群在骨代谢及炎症调控方面有巨大潜力。其中，丁.酸作为重要肠道菌群代产物，在骨代谢和炎症调控方面具有明显的调控作用。同时，有研究表明外源性补充褪黑素可调节肠道菌群以及改变肠道菌群代谢产物短链脂肪酸的功能。本课题组既往的研究表明褪黑素可缓解 Ti 颗粒引起的骨溶解，本研究遂探索了褪黑素是否可通过调节肠道菌群来治疗骨溶解。

研究思路
 

 

分组方案：

Sham：对照组；Ti：Ti 颗粒组；MT：褪黑素组；Anti：水稀释的抗生素混合物
 

主要实验方法：

16S rRNA 基因测序、SCFA（短链脂肪酸）定量检测、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、显微 CT 分析、免疫组织化学和免疫荧光染色、细胞培养与刺激

 

研究结果
 

1. 褪黑素抗骨溶解作用由肠道微生物群介导

褪黑素的治疗作用几乎被抗生素混合物（Anti）阻断，与褪黑素治疗（MT）的小鼠相比，抗生素混合物比褪黑素治疗的小鼠的骨侵蚀显著加重，进一步通过分析 Sham、Ti、MT 组小鼠粪便中收集的微生物样本的 16S rRNA 基因序列，确定肠道菌群对褪黑素的响应的整体结构变化。（图 1）

2. 褪黑素可以增加产生 SCFAs 的细菌丰度

应用线性判别分析发现与 Ti 组相比，MT 组双歧杆菌属、拟杆菌属和瘤胃球菌属显著富集，且这些菌与短链脂肪酸的产生呈正相关，而短链脂肪酸是由肠道微生物群从膳食纤维代谢而来。（图 1）
 

图 1 褪黑素的作用与肠道微生物菌群相关

3. 褪黑素增加丁.酸相关酶的丰度      

为了确定产生短链脂肪酸的细菌变化对短链脂肪酸的影响，我们通过靶向代谢组学分析测量每组小鼠粪便中的短链脂肪酸浓度，服用褪黑素后可以使浓度增加至 Ti 组近 2 倍，使用 PICRUSt2 进行功能预测，在 KEGG 和 Metacyc 数据库中发现的大多数丁.酸合成相关酶都被褪黑素补充剂显著富集。（图 2） 
 

图 2 褪黑素丰富了小鼠丁.酸相关酶的丰度和粪便丁.酸浓度

4. 肠道微生物在褪黑素的作用中不可或缺

为了证实褪黑素是由肠道菌群介导的，小鼠先在抗生素混合物处理后被移植了 Ti 或 MT 组的菌群，MT-trans 组中显示出骨溶解的衰减，在 Ti-trans 组中没有观察到骨溶解的衰减，结果表明褪黑素的作用可以通过粪便微生物群移植来传递。（图 3）
 

图 3 褪黑素的抗骨溶解作用可通过粪便微生物群移植

 

5. 丁.酸盐通过抑制 NLRP3 小体的激活来减少骨溶解

褪黑素可以提高 Ti 颗粒暴露小鼠粪便中丁.酸盐的浓度，然而，丁.酸盐是否与褪黑素的作用有关仍不清楚。因此，我们进一步研究了在 Ti 粒子诱导的骨溶解模型中添加丁.酸盐的反应，结果表明丁.酸盐可以减少骨溶解。

然后验证 NLRP3 小体的激活在骨溶解过程中是必不可少的，我们将 caspase-1 抑制剂（Ac-YVAD-CMK）和 NLRP3 抑制剂（MCC 950）注射到小鼠体内，验证 NLRP3 小体对体内骨溶解的影响，结果证实 caspase-1 和 NLRP3 抑制剂均能有效阻断 Ti 颗粒诱导的骨溶解，结果表明 NLRP3 小体的激活在 Ti 粒子诱导的骨溶解中起重要作用。      在确定骨溶解与 NLRP3 小体激活之间相关性后，了解褪黑素促进的肠道代谢物丁.酸是否通过抑制 NLRP3 小体的激活而发挥抗骨溶解的治疗作用，所以进一步检测了丁.酸处理的 BMDM（骨髓来源的巨噬细胞）中 NLRP3、Caspase-1 和 IL-1β 的相对蛋白表达，结果表明 NLRP3 在细胞裂解液中被抑制，上清液中 Caspase-1 和 IL-1β 也明显受到抑制。（图 4）
 

图 4 丁.酸盐在体内和体外抑制 NLRP3 小体激活

6. 丁.酸盐通过其受体 GPR109A 缓解骨溶解

已有研究表明 GPR109A 作为主要受体参与丁.酸盐调节的稳态，为了确定丁.酸盐的抗骨溶解是否是通过已知的丁.酸盐受体 GPR109A 介导，实验发现 GPR109A 的表达被 BMDM 中的丁.酸盐显著上调。为了证实 GPR109A 在骨溶解中的作用，我们比较了丁.酸盐干预对 GPR109A 缺失和野生型小鼠骨溶解的影响。结果表明丁.酸盐的治疗作用在 GPR109A 缺失的小鼠中大大减弱，与野生型小鼠相比，GPR109A 缺失型小鼠具有几乎相同的骨侵蚀参数，更重要的是，丁.酸盐不能阻止 GPR109A 缺失型小鼠中 NLRP3 小体的激活。（图 5）
 

图 5 丁.酸盐通过其受体 GPR109A 发挥抗骨溶解作用

7. 褪黑素对 NLRP3 小体的抑制作用由肠道菌群介导

之前的研究表明褪黑素具有抑制 NLRP3 小体的能力，所以比较了 Sham 组、Ti 组、MT 组和 Anti 组 NLRP3 小体相关蛋白的表达。褪黑素抑制了 NLRP3、Caspase-1 和 IL-1β 的表达，而褪黑素的抗生素干预对 NLRP3 小体激活没有有效抑制作用，更重要的是，与 Ti 组相比，褪黑素的补充上调了 GPR109A 的表达，而且 GPR109A 很少在丁.酸盐浓度较低的 Anti 组中表达，这再次证明褪黑素抑制 NLRP3 小体和减轻骨溶解的能力主要是由丁.酸盐通过肠道微生物群介导。（图 6）
 

图 6 褪黑素抑制 NLRP3 小体的作用被抗生素减弱

 

结论
 

褪黑素逆转由骨质溶解引发的菌群失调，增加能产生 SCFAs 的微生物的相对丰度，增强丁.酸合成酶的表达，丁.酸盐富集介导的 NLRP3 小体激活的有效抑制是褪黑素对骨溶解的治疗作用的原因，此外，丁.酸盐的作用取决于其受体 GPR109A。因此，褪黑素可能是肠道微生物群的合格调节剂，发挥抗骨溶解以及调节微生物代谢物丁.酸盐的作用。

 

参考文献

Wu Y, He F, Zhang C, et al. Melatonin alleviates titanium nanoparticles induced osteolysis via activation of butyrate/GPR109A signaling pathway. J Nanobiotechnology. 2021;19(1):170.